Técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
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Técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

PCR – Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase
 
A técnica de PCR é extremamente útil  dada a especificidade e rapidez da mesma.
 
Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises. Com apenas um único fragmento de DNA é possível reproduzir milhões de cópias.

Os ensaios de PCR em Tempo Real são muito mais sensíveis, específicos e rápidos, principalmente quando comparados aos testes convencionais, levando de 2 a 3 horas para emitir o resultado.

Para diagnósticos, são amplamente utilizados na infectologia clínica para a detecção de patógenos, identificando infecções virais e bacterianas, em que a cultura dos agentes causadores pode ser muito difícil ou até mesmo impossível. Este método não depende do isolamento ou crescimento do patógeno ou da detecção de uma resposta imune contra o agente.

Em vez disso, o que é detectado nos ensaios são as sequências de ácidos nucleicos dos patógenos. Alguns exemplos de sua aplicação consistem no diagnóstico de dengue, infecções respiratórias, ISTs, anteriormente chamada de DSTs, e meningites.

É utilizada também no diagnóstico de doenças genéticas, identificando mutações e pré-disposição genética para determinadas doenças, como é o caso da trombose.

Essa técnica molecular também é utilizada na oncologia para identificação do cromossomo Philadeplhia, uma alteração citogenética que está associada a algumas formas de leucemia.

A reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) permitiu o rápido desenvolvimento do estudo de sequências de ácidos nucleicos.
Essa técnica foi desenvolvida por Kary Banks Mullis, em abril de 1983, essa técnica de biologia molecular consiste em nada mais que a síntese enzimática de cópias de ácidos nucleicos em laboratório.
O cientista recebeu o prêmio Nobel de química de 1993 por sua descoberta.
técnica de biologia molecular por PCR promove, in vitro, por meio de artifícios de variação de temperatura, o que o organismo realiza naturalmente, em condições fisiológicas – a duplicação de cadeias de DNA, envolvendo nucleotídeos, sequências iniciadoras (primers) e enzima polimerases. Assim, é possível a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucleico, a partir de uma fita molde.
 
O princípio da PCR envolve três etapas básicas por ciclo, estimuladas pelo calor, que são repetidas por várias vezes, em ciclos:
 
– Abertura da fita de DNA que servirá de molde, por desnaturação térmica (etapa com duração entre 30s e 1min a temperatura de 92-96ºC);
– Pareamento de oligonucleotídeos sintéticos, que funcionam como os iniciadores da reação de polimerização, a cada uma das fitas do DNA molde, à região complementar da fita que sofrerá a duplicação (duração de 30s a 1min a temperatura entre 58 e 65ºC);
– Polimerização, através de uma enzima polimerase, das novas fitas de DNA a partir de cada um dos iniciadores, utilizando cada um dos quatro dNTP como substrato da reação de polimerização (duração entre 45s e 1min, a 72ºc).
 
Cada ciclo é repetido em torno de 60 vezes, e promove a amplificação da região alvo determinada conforme afinidade das sequencias iniciadoras (primers).
Assim, o iniciador reconhece, por complementaridade, o local de início do local a ser amplificado, efetua a ligação e sinaliza para a polimerase o início da sequencia a ser replicada.
 
O grande problema inicial foi a desnaturação seguida da enzima polimerase, que, obtida de Escherichia coli, não suportava a temperatura para abertura das fitas de ácidos nucléicos. Assim, a cada ciclo, uma nova quantidade de enzima deveria ser adicionada.
Em 1988, contudo, Randall Saiki e colaboradores substituíram a polimerase de E. coli pela já conhecida Taq polimerase, polimerase da bactéria Thermus aquaticus, que vive em águas quentes de gêiseres e vulcões submersos, e possui um ponto de crescimento ótimo entre 70 e 75ºC.
Assim, essa substituição promoveu maior independência ao processo além de aumentar a confiabilidade por redução de riscos de contaminação.

Metodologias:

PCR CONVENCIONAL

QPCR  –  PCR  EM TEMPO REAL

PCR CONVENCIONAL

Existem 3 etapas que compreendem a reação de PCR:

  1. Desnaturação – O DNA gnômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado. Ou seja, ocorre a separação da dupla fita de DNA.
  2. Anelamento ou Hibridização – os iniciadores ou primers se ligam a fita de DNA que se pretende amplificar. Um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. São eles que irão identificar/marcar qual trecho de interesse do DNA deverá ser copiado.
  3. Extensão ou polimerização – com o ponto de partida já identificado, a Taq polimerase liga-se a fita sinalizada pelo primer, complementando-a. Inicia-se então a extensão do novo fragmento de DNA, formando novamente uma fita dupla de DNA.

Esse ciclo é realizado inúmeras vezes até atingir milhões de cópias. Na PCR convencional, a detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose. Após a coloração, ocorre a visualização do DNA pesquisado.

QPCR – PCR EM TEMPO REAL

Na qPCR, o resultado é visualizado imediatamente, dispensando a eletroforese. Isto é possível pela adição de sondas fluorescentes às reações de PCR. A amplificação do DNA-alvo é monitorada durante o processo de qPCR. A medida que o DNA é amplificado, o nível de fluorescência cresce proporcionalmente.

O equipamento é capaz de detectar a fluorescência eventualmente produzida pela amostra e assim a técnica permite acompanhar a reação e a apresentação dos resultados em tempo real.

Além disso, por meio do monitoramento da taxa de aumento da fluorescência na reação de PCR, é possível determinar com precisão a quantidade de DNA-alvo presente na amostra original. A qPCR pode ser utilizada para se avaliar a presença de um patógeno em uma amostra, podendo ser um teste qualitativo ou quantitativo.

INTERFERENTES NA TÉCNICA DE QPCR

A elevada sensibilidade dessa técnica possibilita excelentes resultados, porém também está sujeita a presença de inibidores e contaminação que podem afetar a sua eficiência. Os plásticos para qPCR tem um grande impacto sobre os ensaios em tempo real e precisam receber um tratamento especial para não interferir na reação, principalmente na leitura do sinal fluorescente. Ocasionam assim um resultado errado, com baixa concentração ou mesmo inviabilizando o processo.

Visualizar os resultados da PCR: através da eletroforese em gel 

Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) através do uso da eletroforese em gelEletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma “banda” no gel, que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de PCR produzindo um fragmento de 400 pares de bases (pb) 

Principais acontecimentos e a evolução dessa técnica:

  • 1983 – Criação da técnica por Kary Mullis.
  • 1985 – Apresentação da pesquisa à comunidade científica e publicação na revista “Science”.
  • 1986 – Taq polimerase – a descoberta da bactéria Termus aquaticus e extração de sua DNA polimerase possibilitou o aperfeiçoamento da técnica, que não necessitava de adição de mais DNA polimerase a cada ciclo, pois a mesma suporta temperaturas acima de 100°C.
  • 1987 – Com a patente da PCR por parte da Perkin, desenvolve-se a automação para controle do aumento e redução da temperatura, neste momento surge o Temociclador.
  • 1992 – Primeiro teste diagnóstico desenvolvido para HIV, descartando o problema da janela imunológica estabelecida pelo vírus.
  • 1993 – Karry Mullis recebe o Prêmio Nobel de Química.
  • 2003 – Desenvolvimento da PCR em Tempo Real ou qPCR– técnica de PCR na qual utiliza-se além dos primers (iniciadores de amplificação), as sondas marcadas, possibilitando a quantificação do alvo em estudo.

Referências bibliográficas disponíveis

Arnaldo, ZAHA, FERREIRA, Henrique Bunselmeyer, and PASSAGLIA, Luciane M. P. – organizadoresBiologia Molecular Básica, 4ª edição. ArtMed, 2012.

MADIGAN, Michael T., MARTINKO, John M., BENDER, Kelly S., BUCKLEY, Daniel H., STAHL, David A. Microbiologia de Brock, 14ª edição . ArtMed, 2016.

PINTO, Terezinha de Andreoli, KANEKO, Telma Mary, PINTO, Antonio F. Controle Biológico de Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos, 4ª edição . Manole, 2015.

MARTINS, Mílton Arruda, CARRILHO, Flair José, ALVES, Venâncio Ferreira, CASTILHO, Euclides. Clínica Médica, Volume 3: Doenças Hematológicas, Oncologia, Doenças Renais, 2ª edição . Manole, 2016.

Paiva-Cavalcanti M, Lorena VMB, Gomes YM. Avanços biotecnológicos para o diagnóstico das doenças infecciosas e parasitárias. Rev Patol Trop. 2008.

CAMARGO, Cleyton F., SILVA, Paulo R. Aplicação das técnicas de PCR e suas técnicas derivadas em diagnóstico molecular.

Estamos a disposição. Nossa equipe técnica tem muito prazer em orientar e esclarecer a todos.

Célia Wada

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