O Zn 2+ inibe a atividade da polimerase do RNA do coronavírus e do arterivírus nos ionóforos in vitro e zinco bloqueia a replicação desses vírus na cultura de células
Abstrato
Aumentar a concentração intracelular de Zn 2+ com ionóforos de zinco como piritiona (PT) pode prejudicar eficientemente a replicação de uma variedade de vírus de RNA, incluindo o poliovírus e o vírus da influenza. Para alguns vírus, esse efeito foi atribuído à interferência no processamento da poliproteína viral. Neste estudo, demonstramos que a combinação de Zn 2+ e PT em baixas concentrações (2 µM Zn 2+e PT 2 µM inibe a replicação do SARS-coronavírus (SARS-CoV) e do vírus da arterite equina (EAV) na cultura de células. A síntese de RNA desses dois nidovírus relacionados à distância é catalisada por uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), que é a enzima central de seu complexo de replicação e transcrição de multiproteínas (RTC). Usando um ensaio de atividade para RTCs isolados de células infectadas com SARS-CoV ou EAV – eliminando assim a necessidade de o PT transportar Zn 2+ através da membrana plasmática – mostramos que o Zn 2+ inibe eficientemente a atividade de síntese de RNA dos RTCs de ambos os vírus. Estudos enzimáticos usando RdRps recombinantes (SARS-CoV nsp12 e EAV nsp9) purificados de E. coli revelaram subsequentemente que o Zn 2+ inibia diretamente aatividade in vitro de ambas as polimerases de nidovírus. Mais especificamente, verificou-se que o Zn 2+ bloqueia o passo de iniciação da síntese do RNA do EAV, enquanto que no caso do SARS-CoV RdRp o alongamento foi inibido e a ligação do modelo reduzida. Quelando o Zn 2+ com MgEDTA, o efeito inibitório do cátion divalente pode ser revertido, o que fornece uma nova ferramenta experimental para estudos in vitro dos detalhes moleculares da replicação e transcrição de nidovírus.
Resumo do autor
Os vírus de RNA de cadeia positiva (+ RNA) incluem muitos patógenos importantes. Eles desenvolveram uma variedade de estratégias de replicação, mas são unificados no fato de que uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) funciona como a enzima principal de sua maquinaria sintetizadora de RNA. O RdRp é comumente incorporado em um complexo de replicação associado à membrana que é montado a partir de RNA viral e proteínas virais e hospedeiras. Dada a sua função crucial no ciclo replicativo viral, os RdRps são os principais alvos da pesquisa antiviral. Sabe-se que concentrações aumentadas de Zn 2+ intracelular comprometem com eficiência a replicação de vários vírus de RNA, por exemplo, interferindo no processamento proteolítico correto das poliproteínas virais. Aqui, não apenas mostramos que a replicação de corona e arterivírus pode ser inibida pelo aumento do Zn 2+níveis, mas também usam complexos de replicação isolados e RdRps recombinantes purificados para demonstrar que esse efeito pode ser baseado na inibição direta dos RdRps de nidovírus. A combinação de protocolos descritos aqui será valiosa para futuros estudos sobre a função de complexos enzimáticos nidovirais.
Introdução
Os íons de zinco estão envolvidos em muitos processos celulares diferentes e provaram ser cruciais para o dobramento e a atividade adequados de várias enzimas celulares e fatores de transcrição. O Zn 2+ também é provavelmente um cofator importante para inúmeras proteínas virais. No entanto, a concentração intracelular de Zn 2+ livre é mantida em um nível relativamente baixo pelas metalotioneínas, provavelmente devido ao fato de que o Zn 2+ pode servir como segundo mensageiro intracelular e pode desencadear apoptose ou uma diminuição na síntese de proteínas em concentrações elevadas [1 ] , [2] , [3] . Curiosamente, em estudos de cultura de células, altos níveis de Zn 2+As concentrações e a adição de compostos que estimulam a importação celular de Zn 2+ , como hinokitol (HK), ditiocarbamato de pirrolidina (PDTC) e piritiona (PT), inibiram a replicação de vários vírus de RNA, incluindo vírus da influenza [4] , vírus sincicial respiratório [5] e vários picornavírus [6] , [7] , [8] , [9] , [10] , [11] . Embora esses estudos anteriores tenham fornecido informações mecanísticas limitadas, isso sugere que os níveis intracelulares de Zn 2+ afetam uma etapa comum no ciclo replicativo desses vírus.